Задачи для практикума (каф.биоинженерии)

1. По белковой инженерии "Сайт-специфический мутагенез: введение направленной точечной мутации в ген белка"  (на базе ИБХ РАН).  

Задача включает в себя: получение компетентных клеток E. coli, трансформация; выделение плазмидной ДНК, анализ плазмиды методом электрофореза в агарозном геле, дизайн олигонуклеотидных праймеров для мутагенеза, введение точечной мутации в ген белка, анализ результатов мутагенеза и расчет его эффективности.

2. Биотехнология. Стерильная ферментация генно-инженерных штаммов бактерий (на базе ГосНИИгенетики).

Подготовка посевного материала. Чашки Петри с селективной средой. Рост в колбах с антибиотиком.

Ферментация в объеме 1-2 л. Аппарат с контролем рН, рО₂, температуры, оборотов мешалки. Определение скорости роста по оптической плотности, по титру культуры (подсчет колоний). Определение расхода субстрата, накопления продукта.

Анализ популяции в конце ферментации (Оценка скорости потери плазмид).

Навыки управления ферментацией по датчику рО₂, по датчику рН.

Расчет выхода на субстрат. Вариант с дробной подачей субстрата (управление по скорости расхода кислорода).

3. Молекулярное моделирование (корпус Б, к.505). 

Моделирование на основании гомологии пространственной структуры слабого нейротоксина TXW6. Целью работы является получение модели пространственной структуры белка на основании его аминокислотной последовательности с помощью методов молекулярного моделирования. В качестве объекта исследования предлагается  слабый нейротоксин (идентификационный код TXW6_NAJNA в банке данных белковых последовательностей SWISSPROT), выделенный из змеиного яда (Naja naja). 

Алгоритм моделирования на основании гомологии включает следующие этапы:

1. Поиск гомологичных последовательностей и их выравнивание с TXW6. Предсказания элементов вторичной структуры с помощью нескольких методов. Анализ консервативных (вариабельных) остатков в аминокислотной последовательности слабого нейротоксина. На данном этапе предполагается знакомство с базами  данных белковых поледовательностей  и программами по предсказанию вторичной структуры, доступными по сети Internet.

2. Распознавание типа укладки полипептидной цепи TXW6 с помощью методов протягивания (threading). Поиск структурных шаблонов - белков, имеющих сходный тип укладки полипептидной цепи, по которому будет моделироваться структура исследуемой аминокислотной последовательности TXW6. Выравнивание данной аминокислотной последовательности со структурными шаблонами.

 Для обеспечения надёжности предсказания предлагается  использовать три метода "протягивания" (программы THREADER2, UCLA_DOE, TOPIT) со сходными алгоритмами расчёта, но отличающихся набором и значениями констант, а также библиотеками структурных шаблонов.

3. Конструирование трёхмерной (3D) модели TXW6 методом моделирования на основании гомологии с помощью программы MODELLER. Получение нескольких вариантов 3D моделей с каждым  из выбранных структурных шаблонов.

4. Оценка качества полученных 3D моделей слабого нейротоксина.

4. Экспрессия белков в бесклеточной системе трансляции 

(НИИТ и ИО МЗ РФ).

Бесклеточная экспрессия генов используется для изучения процессов биосинтеза, сворачивания и процессинга белков. Она также используется для их структурной и функциональной характеристики, что особенно важно для белков, которые трудно или невозможно экспрессировать в клетках (это de novo белки, а также белки, токсичные для клеток). Разработанные методы позволяют характеризовать белки на уровне нанограммов без их выделения в чистом виде. На основе бесклеточной экспрессии разработаны системы селекции белков с повышенным сродством к белкам-партнерам и лигандам. 

     1. Изучение литературы по основным характеристикам используемых систем экспрессии из E. coli, зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика. Варианты экспрессии: одновременная транскрипция и трансляция; последовательные транскрипция а затем трансляция готовых мРНК. 

    2.   Изучение литературы по основным принципам создания стабильных рибосомных комплексов и систем селекции на их основе.  Необходимые требования к генам для экспрессии in vitro и создания рибосомных комплексов. Основные подходы к изучению структурных и функциональных свойств белков, синтезированных in vitro. 

3.     PCR для амплификации фрагмента гена, модифицированного для экспрессии  in vitro, охарактеризовать продукт электрофоретическим анализом. 

4.     Транскрипция полученного фрагмента гена РНК полимеразой бактериофага Т7,  характеристика продукта электрофоретическим анализом.

5.      Трансляция мРНК в системе трансляции из зародышей пшеницы.  Характеристика синтезированного полипептида. В качестве модельного белка может быть использован GFP (green fluorescent protein). Синтез этого белка в биологически активной форме может быть охарактеризован по его флюоресценции.